Portaria n.º 16/97, de 04 de Janeiro de 1997
Portaria n.º 16/97 de 4 de Janeiro Considerando o disposto no Regulamento Relativo às Substâncias e Produtos Indesejáveis nos Alimentos Simples, Matérias-Primas e Alimentos Compostos Destinados à Alimentação Animal, aprovado pelo Decreto-Lei n.º 442/89, de 27 de Dezembro; Considerando que é necessário, dada a evolução dos conhecimentos científicos e técnicos, dispor de um método que permita controlar os teores muito reduzidos de aflatoxina B, fixados pela Portaria n.º 1107/89, de 27 de Dezembro, e posteriormente alterados pela Portaria n.º 1208/91, de 19 de Dezembro; Considerando a necessidade de harmonizar a Directiva n.º 76/372/CEE, da Comissão, de 1 de Março, com as alterações que lhe foram introduzidas pelas Directivas n.º 92/95/CEE e 94/14/CE, da Comissão, de 9 de Novembro e de 29 de Março, relativas ao método de análise comunitário para o doseamento de aflatoxina B; Considerando, por último, que o Conselho Consultivo de Alimentação Animal foi ouvido sobre a matéria, nos termos do artigo 4.º do Decreto-Lei n.º 372/87, de 5 de Dezembro: Manda o Governo, pelo Ministro da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas, ao abrigo do disposto no n.º 7 do artigo 5.º do Regulamento Relativo às Substâncias e Produtos Indesejáveis nos Alimentos Simples, Matérias-Primas e Alimentos Compostos Destinados à Alimentação Animal, aprovado pelo Decreto-Lei n.º 442/89, de 27 de Dezembro, que seja aprovado o método oficial de análise a utilizar para a determinação do teor de aflatoxina B nos alimentos para animais, constante do anexo ao presente diploma e que dele faz parte integrante.
Ministério da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas.
\Assinada em 15 de Novembro de 1996.
Pelo Ministro da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Luís Manuel Capoulas Santos, Secretário de Estado da Agricultura e do Desenvolvimento Rural.
ANEXO Determinação do teor de aflatoxina B em alimentos para animais A - Método por cromatografia monodimensional em camada fina 1 - Objectivo e campo de aplicação. - O método permite determinar o teor de aflatoxina B das matérias-primas e dos alimentos simples; no entanto, não se aplica à polpa de citrinos. O limite inferior de determinação é de 0,01 mg/kg (10 ppb).
Na presença de substâncias de interferência que dificultem as determinações, é necessário recomeçar a análise em conformidade com o método descrito na parte B, 'Determinação de aflatoxina B por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC)'.
2 - Resumo do processo. - A amostra é submetida à extracção com clorofórmio. O extracto é filtrado e uma alíquota é tratada e purificada por cromatografia em coluna de sílica gel. O eluído é evaporado e retomado num volume determinado de clorofórmio ou de uma mistura de benzeno e acetonitrilo. Uma alíquota desta solução é submetida a cromatografia em camada fina. A quantidade de aflatoxina B é determinada no cromatograma, sob irradiação UV, quer visualmente quer por fluorodensitometria, por comparação com as quantidades conhecidas de padrão de aflatoxina B. A identidade de aflatoxina B do extracto do alimento deve ser confirmada pelos processos indicados.
Notas 1 - As micotoxinas são substâncias extremamente tóxicas, pelo que a sua manipulação deve ser efectuada em hottes. Devem ser tomadas precauções especiais quando as micotoxinas se apresentam sob forma liofilizada porque, pela sua natureza electrostática, têm tendência para dispersão nas áreas de trabalho.
2 - Dada a sensibilidade da aflatoxina B à luz, os ensaios devem realizar-se ao abrigo da luz natural ou da luz branca artificial.
3 - Para as soluções aquosas de aflatoxinas, o uso de material de vidro que não tenha sido lavado previamente com ácido pode ocasionar perdas. Deverão tomar-se cuidados especiais com o uso de material de vidro não reutilizável, tal como frascos de auto-amostragem e pipetas Pasteur.
Assim, todo o material de vidro para contacto com soluções aquosas de aflatoxinas deve ser previamente imerso em ácido (por exemplo, ácido sulfúrico, c=2 mol/l) durante algumas horas e, posteriormente, bem lavado com água destilada, de modo a remover quaisquer vestígios de ácido (por exemplo, três vezes, verificando com papel indicador).
Na prática, este tratamento torna-se necessário para o balão de fundo redondo (4.4), balões volumétricos, provetas, frascos ou tubos utilizados para as soluções de calibração e para os extractos finais (particularmente os frascos de auto-amostragem), bem como as pipetas Pasteur eventualmente usadas para a transferência das soluções de calibração ou dos extractos.
3 - Reagentes e auxiliares. - Todos os reagentes devem ser de qualidade 'pró-análise', desde que não seja dada outra indicação.
3.1 - Acetona.
3.2 - Acetonitrilo.
3.3 - Benzeno.
3.4 - Clorofórmio, estabilizado com 0,5% a 1% de etanol a 96% (V/V).
3.5 - n-hexano.
3.6 - Metanol.
3.7 - Éter dietílico, anidro e isento de peróxidos.
3.8 - Mistura de benzeno (3.3) e de acetonitrilo (3.2) 98+2 (V+V).
3.9 - Mistura de clorofórmio (3.4) e de metanol (3.6) 97+3 (V+V ).
3.10 - Gel de sílica para cromatografia em coluna, com granulometria de 0,05 mm a 0,20 mm.
3.11 - Algodão hidrófilo, previamente desengordurado com clorofórmio, ou lã de vidro.
3.12 - Sulfato de sódio, anidro, granulado.
3.13 - Gás inerte, por exemplo, azoto.
3.14 - Ácido clorídrico 1 N.
3.15 - Solução de ácido sulfúrico a 50% (V/V).
3.16 - Terra de diatomáceas, tratada com ácido.
3.17 - Gel de sílica G-HR ou equivalente, para cromatografia em camada fina.
3.18 - Solução-padrão de aflatoxina B a cerca de 0,1 lg/ml em clorofórmio (3.4) ou na mistura de benzeno e de acetonitrilo (3.8), preparada e controlada como indicado no ponto 7.
3.19 - Solução-padrão qualitativa de cerca de 0,1 lg de aflatoxina B e B por mililitro em clorofórmio (3.4) ou na mistura benzeno e de acetonitrilo (3.8).
As concentrações são dadas a título indicativo; devem ser ajustadas de modo a obter a mesma intensidade de fluorescência para as duas aflatoxinas.
3.20 - Solventes para o desenvolvimento: 3.20.1 - Clorofórmio (3.4)+acetona (3.1): 90+10 (V+V), câmara não saturada.
3.20.2 - Éter dietílico (3.7)+metanol (3.6)+água 96+3+1,(V+V+V), câmara não saturada.
3.20.3 - Éter dietílico (3.7) + metanol (3.6)+água 94+ +4,5+1,5, (V+V+V), câmara saturada.
3.20.4 - Clorofórmio (3.4)+metanol (3.6) 94+6 (V+V), câmara saturada.
3.20.5 - Clorofórmio (3.4)+metanol (3.6) 97+3 (V+V), câmara saturada.
4 - Aparelhos e utensílios: 4.1 - Triturador/misturador.
4.2 - Agitador mecânico ou magnético.
4.3 - Papel de filtro plissado para filtração rápida, tipo Schleicher et Schüll ou equivalente, diâmetro: 24 cm.
4.4 - Coluna para cromatografia, de vidro (diâmetro interno: 22 mm; comprimento: 300 mm), com torneira de teflon e reservatório de 250 ml.
4.5 - Evaporador rotativo, actuando sob vazio, com balão de fundo redondo de 500 ml.
4.6 - Frasco de Erlenmeyer de 500 ml, munido de rolha.
4.7 - Equipamento para cromatografia em camada fina.
4.8 - Placas de vidro para cromatografia em camada fina de 200 mmx200 mm, preparadas da seguinte forma (as quantidades indicadas são suficientes para cinco placas): introduzem-se num frasco de Erlenmeyer 30 g de gel de sílica, juntam-se 60 ml de água, tapa-se e agita-se durante um minuto. Espalha-se a suspensão sobre as placas de modo a obter uma camada uniforme de 0,25 mm de espessura. Deixam-se secar ao ar e guardam-se em seguida num exsicador contendo sílica. Quando se utilizarem, activam-se mantendo-as em estufa a 110C durante uma hora. Podem ser utilizadas placas preparadas comercialmente, desde que satisfaçam as características atrás referidas.
4.9 - Lâmpada UV de comprimento de onda de 360 nm. - A intensidade de radiação deve permitir a distinção nítida de uma mancha de l,0 ng de aflatoxina B sobre uma placa para cromatografia em camada fina a uma distância de 10 cm da lâmpada.
4.10 - Tubo graduado de 10 ml de capacidade e rolha de polietileno.
4.11 - Espectrómetro, que permita medições no ultravioleta.
4.12 - Fluorodensitómetro (facultativo).
5 - Técnica: 5.1 - Preparação da amostra (ver observações, parte C, ponto 1).
Moer a amostra de forma que passe, na totalidade, através de um crivo de malha 1 mm (conforme recomendação ISO R 565).
5.2 - Extracção: Introduzem-se 50 g da amostra moída e homogeneizada num frasco de Erlenmeyer de 500 ml (4.6). Adicionam-se 25 g de terra de diatomáceas (3.16), 25 ml de água e 250 ml de clorofórmio (3.4). Tapar o frasco, agitar durante trinta minutos no agitador (4.2); filtram-se por papel de filtro plissado (4.3).
Eliminam-se os primeiros 10 ml de filtrado e recolhem-se, em seguida, 50 ml.
5.3 - Purificação em coluna: Tapa-se a extremidade inferior da coluna de cromatografia (4.4) com um tampão de algodão ou de lã de vidro (3.11) e enche-se a coluna com clorofórmio (3.4) até um terço da altura; juntam-se 5 g de sulfato de sódio (3.12).
Verifica-se se a superfície superior da camada de sulfato de sódio está plana e juntam-se 10 g de gel de sílica em pequenas fracções. Agita-se com precaução, depois de cada adição, para eliminar as bolhas de ar. Deixa-se decantar durante quinze minutos e juntam-se, em seguida e cuidadosamente, 15 g de sulfato de sódio. Abre-se a torneira e deixa-se correr o líquido até este atingir praticamente a superfície superior da camada de sulfato de sódio.
Misturam-se os 50,0 ml do extracto recolhidos em 5.2 com 100 ml de n-hexano (3.5) e transvasa-se quantitativamente a mistura para a coluna. Deixa-se correr o líquido até à superfície superior da camada de sulfato de sódio.
Adicionam-se em seguida 100 ml de éter dietílico (3.7) e deixa-se de novo correr o líquido até à superfície superior da camada de sulfato de sódio.
Durante o decurso destas operações, o fluxo de escoamento deve ser de 8 ml a 12 ml por minuto, tendo o cuidado de nunca deixar secar a coluna.
Eliminam-se os líquidos de escoamento.
Elui-se, em seguida, com 150 ml...
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